Quels types de cribles pouvez-vous réaliser ?
Notre plateforme a la capacité technique de mettre en œuvre des cribles sur cellules humaines en lignée et de préférence adhérentes, au format miniaturisé 96 et 384 puits. Les lignées utilisées pour le criblage de siARNs et de miARNs doivent obligatoirement être transfectables par de petits oligonucléotides.
Pour les quantifications cellulaires, nous sommes équipés d’un microscope de criblage à haut contenu permettant l’acquisition et l’analyse automatisées d’images en microplaques. Cette approche permet le « phénotypage cellulaire », c’est-à-dire la quantification simultanée de paramètres cellulaires multiples (morphologies, intensités de fluorescence, textures…) dans 4 canaux de fluorescence (+ transmission).
Notre plateforme dispose aussi d’un lecteur de plaques multimode capable de mesures en spectrophotométrie, fluorescence, luminescence et dual-luminescence (« flash » et « glow »). Enfin, grâce à un ensemble de laveurs de plaques et de distributeurs fluidiques, nous avons également la capacité de réaliser des criblages par test ELISA.
Nous pouvons prendre en charge la plupart des stratégies de crible courantes :
- Crible direct, où l’effet du perturbateur est directement mesuré sur le processus biologique d’intérêt.
- Crible modificateur, au cours duquel l’effet du perturbateur est mesuré avec et sans traitement modificateur (par exemple, pour quantifier le rôle spécifique de gènes dans la réponse à un traitement radiothérapeutique).
- Crible combinatoire, où des perturbateurs sont combinés deux à deux pour étudier leurs interactions. Le STaRs Assay, qui permet d’identifier les cibles fonctionnelles d’un microARN, est une forme de crible combinatoire.
Qu’est-ce que le STarRs Assay ?
Notre plateforme a développé une approche permettant l’identification par criblage des cibles fonctionnelles d’un miARN (« Suppressor Target Screen Assay » ou « STarS assay », Fig. 3).
Figure 3 : Identification des cibles fonctionnelles d'un miARN par « STarS assay ». A. Un miARN régule une fonction cellulaire en inhibant l'expression d'un ou plusieurs gènes cibles, ce qui se traduit par un phénotype cellulaire « normal ». B. Lorsque le miARN est neutralisé par un inhibiteur (par exemple par un anti-sens du miARN), l'expression du ou des gène(s) cible(s) n'est plus réprimée, ce qui se traduit par un gain de fonction et une modification du phénotype mesuré. C. Le STarS Assay consiste à cribler une banque de siARNs combinés individuellement avec l'inhibiteur du miARN. A l'issue d'un tel crible, l'ensemble gènes ciblés par les siARNs capables de restaurer – même partiellement - le phénotype initial constituent les cibles fonctionnelles du miARN.
Quels types de cribles ne pouvez-vous pas réaliser ?
Concernant les cribles siARNs et miARNs, nous disposons exclusivement de banques humaines, aussi nous ne pouvons pas accepter, pour le moment, les projets de crible sur cellules non humaines. Le laboratoire collaborateur peut toutefois nous fournir une banque compatible avec son modèle cellulaire à partir de laquelle nous pourrons prendre en charge son projet de crible.
Pour des questions de reproductibilité des résultats, nous ne travaillons qu’avec des cellules en lignées. Tout projet de crible sur cellules primaires doit faire l’objet d’une étude de faisabilité au cas par cas.
Nous ne pouvons pas apporter de réponse immédiatement positive à un projet basé sur des lignées cellulaires non adhérentes, souvent difficiles à transfecter, et qui limitent les possibilités d’analyse en imagerie. Un tel projet doit également faire l’objet d’une étude au cas par cas.
Comment se déroule un projet de crible typique ?
Tout projet de crible débute par une étude de faisabilité technique, durant laquelle un cahier des charges est établi, et le cout global de réalisation évalué. Dès lors que tous les partis s’accordent sur les conditions de mise en œuvre du crible, le projet peut démarrer.
Expérimentalement, un projet de criblage se déroule selon plusieurs phases (Fig. 4)
Figure 4 : Structure d’un projet typique de crible
La première consiste à établir un test cellulaire miniaturisé compatible avec l’automatisation, suffisamment reproductible, sensible et spécifique pour assurer une identification robuste des perturbateurs candidats. Cette étape de mise au point, qui dépend du degré d’avancement du test cellulaire au démarrage du projet, nécessite généralement entre 2 et 6 mois de travail, indépendamment de la nature ou de la dimension de la banque à cribler.
Le criblage proprement dit débute toujours par un crible pilote (qui couvre 5-10% de la banque de perturbateurs), durant lequel les conditions expérimentales peuvent être ajustées pour améliorer la robustesse du crible. La durée d’un criblage dépend surtout de la dimension de la banque et du test cellulaire mis en œuvre : par exemple, un crible de petite dimension (quelques centaines de perturbateurs) sur un test simple ne nécessitera qu’une ou deux semaines de travail. A l’inverse, un crible plus vaste (comme le crible d’une banque siRNA pangénomique humaine) sur un test cellulaire multiplexé pourra nécessiter jusqu’à 3 mois de travail.
Le traitement et l’analyse des données de crible permet l’identification des perturbateurs candidats, qui sont ensuite généralement retestés dans un criblage secondaire, soit sur le même test cellulaire, soit sur un test complémentaire. Les perturbateurs dont l’activité est confirmée sur le second test constituent la liste de « touches ».
Selon la banque de perturbateurs, des analyses complémentaires peuvent également être mises en œuvre à partir des résultats du criblage (par exemple, dans le cas d’un crible siRNA, des analyses bioinformatiques peuvent permettre d’identifier les voies de signalisation spécifiques à partir d’une liste de touches).
Quelle est la fourchette tarifaire habituelle d’un projet de crible ?
Le coût en réactifs et consommables d’un projet de criblage siARN pangénomique humain se situe dans une fourchette large comprise entre 15 et 40 K€. Un crible miARN antisens ou mimic pangénomique humain (ou un le criblage d’une petite banque de molécules) nécessite entre 2 et 10 K€ de consommables.
Ces coûts sont essentiellement dépendants du système rapporteur utilisé. Par exemple, le cout d’une quantification d’une GFP exprimée constitutivement est marginal ; à l’inverse la quantification d’un système luciférase peut représenter jusqu’à 70% du cout en consommables d’un crible.
Dans le cadre d’une collaboration académique, seuls les couts en consommables et ceux liés à l’infrastructure (entretien des équipements notamment) sont facturés.
Les prestations pour le privé font l’objet d’une tarification spécifique intégrant l’ensemble des couts de fonctionnement (salaires, charges, amortissement du matériel, frais d’environnement…).
Sous quel délai mon projet peut-il débuter ?
La réponse dépend entièrement du degré d’occupation de la plateforme au moment de la demande. Si le laboratoire demandeur dispose du financement, le délai moyen de démarrage d’un projet est d’environ 3 mois après la première prise de contact.
Combien de « touches » puis-je espérer à l’issue de mon criblage ?
L’expérience montre que la liste finale de touches représente 1 à 3% de la banque criblée.