De la bouche à l’anus, le système gastro-intestinal est l’un des écosystèmes les plus étudiés. La connaissance de sa composition microbienne passe notamment par l’extraction et le séquençage de l’ADN des micro-organismes qui l’habitent. Entre prélèvement de l’échantillon et analyse informatique, des chercheurs de l’Inra et du CEA (Institut François Jacob/Génoscope) et leurs partenaires, ont étudié l’impact de la méthode d’extraction de l‘ADN sur la composition microbienne d’échantillons de selles humaines. Ils proposent un protocole standardisé d’extraction d’ADN à même de faciliter les analyses à grande échelle du microbiote et la comparaison des résultats.
Dans le cadre d’un projet international2, ce ne sont pas moins de 21 protocoles d’extraction d’ADN qui ont été comparés dans 11 pays de l’hémisphère nord et sur trois continents (Europe, Amérique et Asie). Kits d’extraction commerciaux ou protocoles des laboratoires eux-mêmes ont été mis en œuvre par chaque partenaire, pour évaluer les mêmes échantillons de selles, soit huit échantillons provenant de deux individus.
L’extraction de l’ADN, une étape clé de l’analyse
Les scientifiques de l’Inra et du CEA, et leurs partenaires, ont ainsi mis en évidence que, si toutes les étapes d’analyse des échantillons sont critiques, l’extraction de l’ADN est la plus susceptible d’en affecter les résultats, générant des variations plus importantes que certains facteurs biologiques (p. ex. différences entre individus ou différences au cours du temps pour un même sujet) ou que d’autres étapes techniques (p. ex. conservation de l’ADN).
La quantité d’ADN extraite et son intégrité sont ainsi largement affectées par le protocole d’extraction et impactent la composition de l’échantillon. Sur 366 espèces bactériennes testées, 90 (25 %) sont affectées par le protocole d’extraction et peuvent être sous-représentées. La majorité d’entre elles sont des bactéries à Gram positif (lesquelles représentent quelque 37 % des bactéries du microbiote) dont la paroi résiste plus aux forces mécaniques mobilisées lors de l’extraction.
Vers un protocole standardisé, performant et transférable
Les scientifiques ont ensuite évalué la transférabilité et quantifié la précision des protocoles d’extraction de l’ADN les plus performants en travaillant sur une communauté microbienne synthétique constituée de souches représentant 10 espèces bactériennes.
1 La métagénomique consiste à étudier collectivement les gènes d’une communauté microbienne dans son ensemble (bactéries, virus, champignons, archées...), sans exiger l’accès aux microbes isolés par culture au laboratoire. On analyse et modélise la diversité et la composition de communautés complexes par séquençage haut débit de leur ADN.
2 Ce travail a été réalisé dans la cadre du projet International Human Microbiome Standards – IHMS (EU, FP7, 2011-2015).
Au terme de ces différentes évaluations, les chercheurs de l’Inra et du CEA et leurs partenaires, ont proposé un protocole standard de traitement des échantillons de selles humaines, de l’échantillonnage à l’analyse bioinformatique en passant par l’extraction et le séquençage de l’ADN.
Alors qu’aujourd’hui la communauté scientifique internationale s’investit massivement à propos du microbiote intestinal humain, alors qu’il n’existait pas jusque-là de protocoles standards, les chercheurs, grâce à cette démarche de structuration des méthodes de métagénomique, proposent un protocole performant, transférable et automatisable pour l’extraction d’ADN. Celui-ci est inclus dans une chaine complète de procédures standardisées disponibles en ligne, qui contribueront, dans le domaine du microbiote humain, animal et au-delà, à optimiser la qualité des données produites et leur comparaison.
Chambre de Freter utilisée pour l'étude du microbiote intestinal en milieu confiné et contrôlé. © Inra, NICOLAS Bertrand