La microscopie de localisation de molécules uniques (SMLM) permet d’améliorer la résolution de la microscopie par fluorescence, classiquement limitée par le phénomène de diffraction. Un défi actuel consiste à travailler à température cryogénique pour mieux préserver la structure native des échantillons, comme en cryo-microscopie électronique. La SMLM repose sur l’utilisation de fluorophores capables de passer efficacement d'un état fluorescent à un état non fluorescent. Mais, hélas, cette photo commutation fonctionne très mal à très basse température.
Des chercheurs de l'Irig, en collaboration avec l'université de Göttingen en Allemagne, ont donc étudié les propriétés de cryo-commutation de la protéine fluorescente rsEGFP2. En combinant la cristallographie aux rayons X avec la spectroscopie optique et la cryo-SMLM à l'aide d'un microscope dédié, ils ont découvert que rsEGFP2 commute toujours à - 170 °C, mais par un nouveau mécanisme. A température ambiante, la commutation est basée sur l'isomérisation
cis-trans du chromophore, un changement conformationnel important. Mais à basse température les données suggèrent la formation de « radicaux » sans changement conformationnel substantiel (voir
figure).
De plus, les chercheurs ont observé que la fraction de molécules rsEGFP2 qui cryo-commutent efficacement avant photo-destruction (photoblanchiment) augmente d'environ 30 % en appliquant une illumination UV à 355 nm, au lieu de 405 nm comme classiquement utilisé pour la SMLM à température ambiante. Ainsi, un laser à 355 nm améliore considérablement la densité de marquage effective pour la cryo-SMLM.
Cette étude ouvre la voie à l'obtention d'images cryo-nanoscopiques mieux résolues. L'objectif est maintenant d'appliquer l'illumination UV optimisée sur des échantillons biologiques, notamment dans le cadre d'études associant la cryo-SMLM et la cryo-tomographie électronique, un défi majeur pour la biologie structurale et cellulaire intégrée d'aujourd'hui.
Figure : Changements de structure du chromophore rsEGFP2 lors de la commutation à température ambiante (à gauche) ou à température cryogénique (à droite). L'état fluorescent est représenté en vert et l'état non fluorescent en gris. En arrière-plan, vue artistique du microscope cryo-SMLM. © Virgile Adam / IBS