Alors qu’il fallait jusqu’en 2011 utiliser des cristaux de taille submillimétrique ( 50-100 µm) pour espérer résoudre une structure macromoléculaire à résolution atomique, des échantillons micro- voire sous-micro-métriques peuvent désormais être utilisé à dessein. Ce changement de paradigme a été permis par l’avènement des méthodes de diffraction en série, notamment la cristallographie sérielle à l’échelle de la femtoseconde (SFX) implémentée dans les lasers à électrons libres (XFEL), mais aussi grâce à l’exploitation de l’interaction plus forte des électrons avec la matière, permettant d’obtenir des données de diffraction utiles à partir de nanocristaux présentés au faisceau d’électrons dans un environnement cryogénique. Le bénéfice de l’approche sérielle a été démontré pour la diffraction électronique (diffraction électronique sérielle ou SED), mais le nombre d’échantillons jusqu’ici étudiés par cette méthode reste anecdotique. Parallèlement, la plupart des synchrotrons ont vu (ou vont voir) leur brillance augmentée de deux ordres de grandeurs, à la faveur de leur mise à jour en sources synchrotrons quatrième génération, posant la question de savoir si certaines des structures aujourd’hui résolues dans les XFEL ou les microscopes électroniques pourraient un jour être résolues par cristallographie sérielle au synchrotron (SSX). Spécifiquement, c’est la SSX basée sur l’utilisation de nano-faisceaux de rayons X (nano-SSX) qui doit être interrogée, pour des cristaux micro- voire sous-micro-métriques. En vue d’évaluer les avantages et limites de chacune de ces méthodes, nous avons au cours de notre thèse comparé leur performance en utilisant comme échantillons modèles des nanocristaux provenant de toxines recombinantes produites in-vivo par la bactérie Bacillus thuringiensis (Bt). Dans ce contexte, nous nous sommes principalement intéressés à des protéines naturellement cristallines dont les structures avaient préalablement été déterminées à haute résolution par SFX (Cry11Aa, Cry11Ba, Cyt1Aa). Nos expériences ont démontré la faisabilité de collecter des données de diffraction à partir de nano-cristaux par nano-SSX. Bien que la résolution des données soit actuellement trop basse pour autoriser une détermination de structure, cette méthode présente des perspectives d’amélioration en termes de temps et de méthode de collecte des données, lesquelles pourraient permettre de dépasser ses faiblesses, à moyen terme. En ce qui concerne la SED, nos recherches ont montré la pertinence de la méthode pour collecter des données à haute résolution à partir de nanocristaux de protéines. Cependant, en raison de problèmes inhérents au microscope et à sa correction imparfaite des aberrations introduites dans le chemin d’électrons, l’indexation des données a été contrariée, expliquant qu’aucune détermination de structure n’ait été possible avec cette technique. Grâce à la Micro-ED, nous avons pu déterminer la structure de la toxine Cry11Aa (Bacillus thuringiensis serovar israelensis) à partir de beaucoup moins de nanocristaux recombinants produits in-vivo, mais à des résolution et complétude plus basses que celles obtenues par SFX. Ainsi, nos études confortent l’hypothèse selon laquelle la SFX est la méthode phare pour déterminer de nouvelles structures macromoléculaires à partir de nanocristaux. C’est ainsi cette méthode que nous avons choisi pour étudier des souches naturelles de Bt et vérifier la conservation de la structure et du packing de ses protéines naturellement cristallines lors de l’expression et de la cristallisation recombinante dans des souches acrystallifères de Bt – i.e. en isolation de l’ensemble des autres protéines qui sont co-exprimées voire co-cristallisent dans le contexte naturel. Nos structures ‘naturelles’ des toxines Cry11Ba (Bacillus thuringiensis serovar jegathesan), Cry11Aa et Cyt1Aa (Bacillus thuringiensis serovar israelensis) démontrent que les structures et packing précédemment résolus et rapportés sont correctes, mais aussi qu’il est désormais possible de ne pas recourir à l’expression recombinante pour obtenir des structures à partir des cristaux de Bt. Illustrativement, nous avons pu déterminer, à haute résolution, les structures inédites des toxines Cyt2Bb (Bacillus thuringiensis serovar jegathesan) et Cry26Aa (Bacillus thuringiensis serovar finitimus) à partir des souches naturelles. Enfin, nous avons investigué les moyens par lesquels la consommation d’échantillon pourrait être réduite en SFX, notamment une nouvelle méthode de purification des nanocristaux et leur présentation par un jet visqueux.​
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