L’expression acellulaire (ou « cell-free »), est très utilisée pour la production d’échantillons de protéines pour des études de biologie structurale. L’expression cell-free utilise les machineries de traduction et de transcription de la bactérie E. coli pour synthétiser des protéines dans un milieu ouvert, c’est-à-dire sans paroi bactérienne. Pour des applications RMN, des acides aminés isotopiquement marqués peuvent être utilisés directement dans la réaction pour synthétiser uniquement la protéine d’intérêt. La rapidité de production et la simplification des procédés de purification ont permis la résolution de nombreuses structures par RMN mais des limitations sont apparues. Premièrement, la taille des protéines à étudier avec un marquage uniforme ne peut pas être supérieure à 20 kDa. Deuxièmement, pour des protéines de poids moléculaire supérieur, il faut synthétiser une quantité plus grande de protéine en gardant un coût raisonnable. Enfin, il serait souhaitable de pouvoir utiliser la perdeutération ou la protonation sélective pour l’étude par RMN de protéines de haut poids moléculaire afin de simplifier les spectres RMN, ce qui à ce jour reste complexe ou jamais réalisé.
​ Le but de cette thèse était de développer de nouveaux protocoles pour le marquage isotopique pour l’étude de protéines de haut poids moléculaire. En optimisant le milieu réactionnel, la co-expression, en utilisant des extraits bactériens spécifiques et des acides aminés deutérés, je propose un protocole complet pour la perdeutération dans l’eau (H2O). Ce protocole permet d’observer directement les groupes amide sans étapes d’échanges passifs ou actifs des protons et son application a permis l’attribution d’un fragment Fab d’anticorps. De plus, j’ai défini la composition du milieu de réaction pour les marquages des groupes méthyles dans un environnement perdeutéré avec l’utilisation de précurseurs ou d’acides aminés et je l’ai appliqué pour l’attribution par mutagénèse des groupes méthyles des leucines d’une protéine de 500 kDa par RMN. L’interprétation des spectres RMN restant complexe, j’ai exploré la voie de la simplification avec l’utilisation d’un ARNt suppresseur de non-sens permettant un marquage isotopique position spécifique de groupe méthyle de protéine de haut poids moléculaire. Ce type de marquage isotopique permet d’avoir des sondes pour l’étude de la dynamique et des interactions de ce type d’assemblage macromoléculaire.
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