La pandémie de COVID-19, causée par le coronavirus SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2), a coûté la vie à plus de 7 millions de personnes et est à ce jour la pandémie la plus impactante du 21e siècle. Afin de proposer une stratégie de développement d'antiviraux, il est nécessaire de comprendre en les mécanismes qui sous-tendent l'infection virale. La machinerie de réplication virale est une cible importante pour l'inhibition des virus. Il est donc nécessaire de comprendre la base moléculaire de la réplication virale du SARS-CoV-2.
La machinerie de réplication virale du SARS-CoV-2 comprend la protéine de la nucléocapside (N) et le complexe de réplication-transcription (RTC), composé de protéines non structurelles (nsps). La fonction première de la protéine N est d'empaqueter le génome viral pour le protéger de la reconnaissance du système immunitaire inné de la cellule hôte. La protéine N est abondamment exprimée dans les cellules infectées. Elle se colocalise avec les vésicules à double membrane (DMVs), connus pour être les sites de réplication des coronavirus. Les DMVs contiennent de l'ARN viral nouvellement synthétisé qui sort par les pores des DMVs, formés par les oligomères des protéines nsp3 et nsp4. L'interaction essentielle entre N et son partenaire viral nsp3a a été décrite à une résolution atomique. Le domaine replié N-terminal de nsp3a, appelé Ubl1, interagit avec le domaine intrinsèquement désordonné N3 de N avec une affinité de 30 nM. Les domaines repliés N2 et N4 sont rapprochés de Ubl1, formant un complexe très compact. Nous avons étudié l'interaction induite entre N2 et Ubl1 par résonance magnétique nucléaire (RMN). Les sites d'interaction ont été cartographiés sur les structures cristallines disponibles de Ubl1 et de N2. Le doigt de liaison à l'ARN de N2 contient un site d'interaction, liant Ubl1 avec une affinité de 149 μM, fournissant une explication possible du résultat précédemment observé de l'annulation de la liaison de l'ARN court à N lors de la liaison à Ubl1.
Diverses modifications post-traductionnelles (PTM), telles que la phosphorylation, peuvent affecter l'activité des protéines. De nombreux virus recrutent les kinases de la cellule hôte pour réussir à se répliquer et à transcrire le génome ; et le SARS-CoV-2 ne fait pas exception. La protéine N est hyperphosphorylée dans les cellules infectées, et cette PTM serait cruciale pour le cycle viral. Cependant, la fonction et les détails moléculaires de la phosphorylation de la protéine N restent mal compris, ce qui nous a incités à étudier l'effet de la phosphorylation de la protéine N du SARS-CoV-2 sur sa fonction moléculaire.
​ Le domaine central désordonné N3 de la protéine N comprend une région riche en SR (résidus 176-206) qui est hyperphosphorylée dans les cellules infectées. En utilisant la RMN, nous avons étudié la phosphorylation in vitro de la protéine N du SARS-CoV-2 avec un triplet de kinases récemment proposé : la sérine arginine protéine kinase 1 (SRPK1), la glycogène synthase kinase 3 (GSK-3) et la caséine kinase 1 (CK1). La réaction a permis d'obtenir 14 sites de phosphorylation répartis uniformément dans la région riche en SR. Nous avons identifié que huit sites de phosphorylation, dont S180, S184, S188, S190, S194, T198, S202 et S206, sont nécessaires à l'annulation de la liaison à l'ARN. La région riche en SR hyperphosphorylée se lie à la même interface qu'un ARN simple brin, révélant un mécanisme d'auto-inhibition. La phosphorylation par une autre kinase physiologiquement pertinente - la protéine kinase A (PKA) - n'empêche pas la liaison de l'ARN, ce qui indique la spécificité du schéma de phosphorylation pour l'inhibition. La cascade de phosphorylation a également affecté les interactions à longue portée entre les domaines de liaison à l'ARN, de liaison et de dimérisation de N, ce qui suggère un rôle possible de la phosphorylation dans la régulation de l'empaquetage ou du dépaquetage du génome viral.
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