Les anticorps monoclonaux (mAb) sont des produits bio thérapeutiques ayant apporté de nombreuses solutions pour le traitement de maladies létales ou chroniques. En raison de ce potentiel thérapeutique élévé, le poids des mAbs sur le marché du médicament est en croissance constante. En industrie pharmaceutique, les mAbs sont principalement exprimés en cellules ovariennes de hamster chinois (CHO). Afin de valider l’activité de chaque lot de production, il est impératif de s’assurer de la qualité structurale des mAbs produits. Parmi les nombreuses techniques analytiques utilisées jusqu’à présent, aucune n’offre une résolution suffisante pour apporter une réponse structurale à l’échelle atomique sur les pertes d’activité thérapeutique observées à la suite d’études de stress. Pour cela, la RMN 2D 1H-13C des groupements méthyles, donnant accès à une résolution beaucoup plus élevée, s’avère prometteuse. En effet, les groupements méthyles des anticorps sont distribués uniformément sur la structure des mAbs et leurs caractéristiques physico-chimiques en font des sondes idéales pour suivre par RMN toute perturbation de la structure des mAb à l’échelle atomique. Cependant, l’utilisation de ces spectres RMN 2D 1H-13C, qui reflètent la structure des mAb à l’échelle atomique, est actuellement limitée à la comparaison ‘’d’empreintes spectrales’’ à un spectre de référence. En effet, l’attribution de chaque signal RMN à son groupement méthyle dans le mAb doit être réalisée en amont pour corréler les pertes d’activités observées avec perturbations observéés sur les spectres RMN. Ce processus d’attribution nécessite l’enrichissement en isotopes stables (13C,15N,2H) des mAbs. Cependant, aucune méthode de marquage isotopique pour les protéines produites en cellules CHO n’a été proposée à ce jour.
Dans ce contexte, ces travaux de thèse ont eu pour ambition de développer des protocoles robustes de marquages isotopiques permettant l’attribution des résonances RMN des groupements méthyles d’un anticorps exprimé en cellules CHO. Pour cela, une méthode de marquage isotopique des groupements méthyles (13CH3) de l’anticorps anti-LAMP1 exprimé en cellules CHO a été développée permettant ainsi l’acquisition d’expériences RMN 2D 1H-13C des groupements méthyles de haute qualité. Cependant, la perdeutération des protéines, nécessaire à l’attribution des expériences RMN 3D d’un anticorps, est impossible en cellules de mammifères. Pour résoudre ce problème, une méthode de marquage isotopique des fragments Fab et Fc de l’anticorps a été développée en système d’expression acellulaire (Cell-Free). En effet, contrairement aux cellules CHO, l’utilisation de ce système permet la production de protéines en solvant deutéré.
​ Ainsi, les fragments uniformément marqués U-[2H,13C,15N] ont été produits pour l’acquisition d’expériences RMN 2D 1H-15N et 3D, permettant de proposer pour la première fois l’attribution des résonances RMN 1H-15N du squelette d’un fragment Fab d’un anticorps. Puis, une méthode de marquage isotopique optimisée 13CH3 spécifique des acides aminés portant un groupement méthyle a été appliquée sur le fragment Fab perdeutéré et exprimé en système cell-free, permettant ainsi d’attribuer les résonances des spectres RMN 1H-13C des groupements méthyles de ce même fragment Fab. La superposition des spectres RMN 1H-13C attribués du fragment Fab exprimé en système cell-free avec ceux de l’anticorps marqué 13CH3 en cellules CHO a ensuite permis de transférer l’attribution des groupements méthyles du fragment Fab vers le spectre de l’anticorps exprimé en cellules CHO. Ces travaux ouvrent la possibilité d’utiliser la RMN des groupements méthyles pour les caractérisations structurale et dynamique ainsi que pour les études des interactions et des modifications des mAb thérapeutiques à l’échelle atomique.

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