Ce projet de thèse s’est articulé autour de la mise au point de métalloenzymes artificielles et de la catalyse hétérogène. Dans le but de contribuer au development des réactions abiotiques catalysées par ces enzymes, nous nous sommes interessés aux reactions d’époxydation d'alcène et de cycloaddition du CO2, dans le cadre d’un réaction cascade. Pour y parvenir, nous avons proposé une series d’ enzymes epoxydases produites selon deux modes de préparation distincts à partir de la protéine NikA, transport du Nickel chez la bactérie. Le premier repose sur des interactions supramoléculaires entre les résidus présent dans la cavité de la protein et le complexe. Le second est basé sur la modification covalente d'une cystéine introduite dans NikA par mutagenese dirigée. Ceci a conduit au développement de cinq époxydases artificielles qui ont démontré des activités intéressantes avec l'acide peracétique et l'époxydation aérobie selon la méthode de Mukaiyama. Un des principaux acquis de ce travail est la demonstration du mode d’insertion covalente, démontré par diffraction X et spectrometrie de masse. Egalement, nos efforts d’optimisation ont mis en lumière l'influence de la méthodologie de préparation des métalloenzymes artificielles sur la stéréosélectivité de la réaction. En effet, l'optimisation des essais d'ancrage covalent d’un complexe Mn(salen) modifié sur le mutant NikA-H416C a conduit à un excès énantiomérique de 90% sur l'époxydation aérobie du cis-β-méthylstyrène. Pareillement, le mutants cysteines de NikA associés à un complexe Co(salen) lié de manière covalente, ont conduit à la production d’enzymes pour la cycloaddition du CO2 qui se sont avérées efficaces dans des conditions assez douces. L'association de ce complexe Co(salen) avec un complexe d'époxydation portant un mode d’ancrage orthogonal (interaction supramoléculaire) sur un échafaudage mutant NikA unique, a permis la création d’une enzyme duale capable de catalyser une transformation d’époxydation-cycloaddition du CO2 en cascade. Cette enzyme s'est avérée active pour la formation de carbonates cycliques à partir du styrène et stable jusqu’à cinq essais catalytiques independants. Bien que une optimisations de ces systémes soit nécessaire, ce projet a ouvert la voie à la conception d’enzymes artificielles à partir de la protéine NikA grâce à une récente méthodologie d'ancrage, la modification covalente, orthogonale au mode d'ancrage supramoléculaire caractéristique de la cavité de NikA. Ce travail permettrra d’ouvrir de nouveaux champs d’applications pour les enzymes artificielles en biologie de synthèse.

Contact : Stéphane Ménage