Les lasers X à électrons libres (XFELs) sont des installations à grande échelle qui produisent des impulsions de rayons X très brillantes et courtes. Les XFELs, complémentaires des synchrotrons, permettent de déterminer la structure des protéines fragiles à partir de petits microcristaux et d'examiner leur dynamique avec une résolution temporelle femtoseconde à l'aide d'une suite de techniques connues sous le nom de cristallographie sérielle femtoseconde (SFX). Le but de ce doctorat consistait à examiner les intermédiaires de courte durée allant de la pico- à la microseconde dans deux protéines sensibles à la lumière en utilisant la SFX résolu en temps (TR-SFX) aux XFELs. Les deux systèmes qui ont été étudiés étaient une photoenzyme, appelée photodécarboxylase d'acide gras (FAP) et une protéine fluorescente photocommutable réversible (RSFPs), appelée rsEGFP2. La FAP est l'une des trois enzymes découvertes à ce jour, dont l'activité catalytique nécessite un flux continu de lumière. La FAP, qui abrite un cofacteur FAD, est impliquée dans le métabolisme des lipides dans les microalgues et catalyse la décarboxylation des acides gras libres en alcanes ou alcènes en réponse à la lumière bleue. Nous avons été en mesure de résoudre la structure SFX sans dommage par des rayons X de l'état "off" de la FAP à une résolution de 2 Å qui a confirmé l'observation faite dans une structure cryo-MX à haute résolution selon laquelle une flexion inhabituelle de l'anneau isoalloxazine du FAD est présente dans l'état oxydé. Notre étude TR-SFX a ensuite permis de suivre en temps réel la décarboxylation induite par la lumière. Une description détaillée de l'analyse des données TR-SFX sur FAP ainsi que l'extrapolation du facteur de structure des états intermédiaires est présentée. Les RSFPs et donc rsEGFP2 sont des outils essentiels dans la nanoscopie de fluorescence avancée des cellules vivantes. Elles peuvent être basculées à plusieurs reprises entre un état fluorescent (on) et un état non fluorescent (off) par irradiation avec de la lumière à deux longueurs d'onde différentes. Basé sur les structures intermédiaires de réaction déterminées par TR-SFX sur rsEGFP2 parental déterminées à l'échelle de temps pico- à nanoseconde, deux variants rationnellement conçus du rsEGFP2 ont été générés. Dans cette thèse, les structures "off" des variants ont été résolues par SFX. De plus, des expériences TR-SFX nanosecondes sur ces variants de rsEGFP2 ont été menées. Des structures intermédiaires nanosecondes TR-SFX sur des variants de rsEGFP2 ont été décrites et une comparaison systématique de données SFX et SSX a été effectuée, en vue d’expériences résolues en temps au synchrotron (TR-SSX).

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