La voie de réparation par excision nucléotidique (NER) est responsable de l'élimination de lésions très distinctes structurellement et chimiquement. Ces lésions qui sont généralement volumineuses peuvent provoquer des distorsions de la double hélice de l'ADN. Elles sont introduites dans le génome par des facteurs exogènes comme l'irradiation UV ou divers cancérogènes. La reconnaissance de substrats aussi diversifiés par les protéines Uvr dans les bactéries, est encore en grande partie incompris. Pour répondre à cette question, nous avons développé un test d'incision in vitro utilisant le système NER de la bactérie résistante aux radiations, Deinococcus radiodurans, composé de 4 protéines: UvrA1, UvrB, UvrC et UvrD. L’hélicase UvrD n’est pas essentielle pour l’incision. Contrairement aux études antérieures qui utilisaient des protéines Uvr de bactéries thermophiles, la reconstitution de ce système UvrABC repose sur l'utilisation de protéines purifiées à partir d'une même bactérie mésophile. L'activité d'incision a été évaluée soit sur des oligonucléotides d'ADN courts contenant des bases modifiées, soit sur de l'ADN plasmidique traité avec différents agents génotoxiques. Dans cette étude, nous avons optimisé le test d'incision et déterminé les composants minimaux et leurs concentrations optimales nécessaires pour une réparation efficace des lésions volumineuses. Ce test a permis d'explorer la spécificité de substrat du NER bactérien notamment en déterminant la nature et l'abondance des lésions réparées par les protéines Uvr par HPLC-MS/MS, la cinétique de réparation et la nature du produit libéré résultant du clivage du substrat. Nos données révèlent des différences nettes dans la réparation des différents substrats. Le test d'incision a également été utilisé pour mieux appréhender le rôle des différents domaines de la protéine UvrC dans le processus de réparation, qui reste l'une des étapes les plus énigmatiques du NER. Dans l'ensemble, ces études ont éclairci plusieurs aspects de cette voie de réparation et fournissent à la communauté scientifique un outil puissant pour de futures études.