Les protéasomes sont de grands assemblages macromoléculaires ubiquitaires composés d’un complexe catalytique 20S et d’une particule régulatrice comprenant un module AAA-ATPase. Cette machine cellulaire est chargée de dégrader sélectivement les protéines intracellulaires pour permettre le renouvellement du protéome, éliminer les protéines défectueuses et contrôler de nombreuses fonctions biologiques. Le travail de cette thèse avait pour objectif de mettre à jour les mécanismes qui permettent aux complexes AAA-ATPase de déplier sélectivement les protéines substrat et de les transférer à la particule 20S, dans laquelle elles sont détruites. Pour cela, une approche novatrice a été utilisée en combinant la diffusion de neutrons aux petits angles résolue en temps (TR-SANS) avec la spectroscopie de fluorescence permettant de suivre l’activité biochimique. Le protéasome de l’archée hyperthermophile Methanocaldococcus jannaschii, a été utilisé comme système modèle. Il est composé de la protéase 20S et de la particule régulatrice AAA-ATPase PAN. Un variant de la protéine fluorescente GFP a été utilisé comme protéine substrat. Les données obtenues montrent que l’activité de dépliement de PAN génère des formes de GFP dénaturée formant des agrégats. En revanche, l’association avec la particule 20S prévient la formation de ces espèces et indique qu’une fois le dépliement d’une protéine par PAN engagé, les processus de transfert dans le complexe 20S et de dégradation sont étroitement couplés. L’analyse des spectres de diffusion neutronique du substrat GFP montrent que la population de GFP native disparait rapidement au profit des peptides générés par la protéase 20S, comme confirmé par une analyse en spectrométrie de masse. Cela démontre le caractère hautement processif du protéasome. Enfin, deux modes d'action de PAN ont été mis en évidence selon la quantité de protéines à dégrader par rapport au protéasome PAN-20S. Ces travaux permettent de valider expérimentalement un des modèles de fonctionnement du protéasome préalablement proposés et soulignent l’importance d’un contrôle de l’association des protéasomes in vivo. Cette étude met également en valeur l’intérêt de la technique TR-SANS pour étudier la dynamique fonctionnelle de grandes machines cellulaires.