Les biomarqueurs sanguins sont des molécules qui signent par exemple la présence d’une maladie, et ceci avec une sensibilité et une spécificité élevées. Leur détection est de la plus haute importance pour mieux détecter les signes prédictifs ou précoces de certaines maladies. Plusieurs techniques existent mais la quantification d’une cible tel un biomarqueur présent à de très faibles concentrations dans un échantillon complexe (sang, urines, eaux polluées etc.) reste actuellement un défi.

Différentes techniques ont été développées dont l’ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) qui fait appel à deux anticorps différents et à une amplification enzymatique. Cependant, l’ELISA est parfois limitée voir inefficace lorsque la cible est présente à de très faibles concentrations. Alors que l'amplification enzymatique est linéaire dans le temps, des amplifications exponentielles à base d’oligonucléotides (des brains courts d’ADN ou d’ARN synthétiques) ont été développées et sont à la base de la technique de PCR. Deux variantes de l’ELISA existent :
- l’immuno-PCR, lorsque l'amplification enzymatique de l’ELISA est remplacée par une amplification exponentielle de l’ADN par PCR tout en conservant la reconnaissance du biomarqueur par des anticorps, et
- l’apta-PCR ou l’un des deux anticorps est substitué par un aptamère auquel une courte séquence nucléotidique est greffée pour amplification par PCR. L’immuno-PCR nécessite cependant deux anticorps spécifiques de la cible recherchée ainsi que le développement d'un anticorps conjugué à l’ADN qui la rendent compliquée et coûteuse. L'utilisation d'aptamères comme substitut aux anticorps rend l’apta-PCR très intéressante, notamment dans des milieux complexes.
Néanmoins, ces deux variantes présentent les inconvénients de l'amplification par PCR, à savoir la nécessité de travailler à plusieurs températures et une grande sensibilité aux inhibiteurs présents dans les échantillons à étudier. L'amplification isotherme médiée par boucle, ou LAMP, représente alors une alternative intéressante. C’est l'une des méthodes les plus spécifiques et les plus sensibles parmi les amplifications isothermes, elle est de plus moins sensible aux inhibiteurs présents dans les échantillons biologiques et présente l'avantage d'être réalisée à température constante.

Des chercheurs de l’Irig [collaboration] ont fait la preuve de concept d’un essai apta-LAMP utilisant la thrombine (une protéine impliquée dans la coagulation) comme biomarqueur. Ils ont ainsi utilisé deux aptamères décrits pour se lier à deux épitopes différents de cette protéine pour former un sandwich stable (Figure). Le test développé est basé sur une amplification de l'ADN faisant appel à une structure en forme d’haltère (Brevet) ne nécessitant que 2 amorces à la place de 4 ou 6. De façon originale, les chercheurs ont introduit une séquence aptamère à différentes positions de la structure en haltère afin d'analyser l’impact sur l'amplification et la reconnaissance de la thrombine. L'amplification de ces différents altères a été validée en moins de 30 minutes et la détection quantitative de la thrombine réalisée avec une limite de détection de 100 pM et une gamme de quantification de 3 ordres de grandeur correspondant aux conditions physiologiques. Credit image CEA​


L’échantillon dans lequel la présence d’un biomarqueur est recherchée (ici la protéine thrombine) est dans un premier temps mis en contact avec des billes magnétiques sur lesquelles un premier aptamère présentant une affinité avec la thrombine est greffé. La structure haltère comprenant le second aptamère est ensuite ajoutée et formera un sandwich avec la thrombine si celle-ci est présente dans l’échantillon à analyser. Une amplification LAMP en présence de 2 amorces sera ensuite réalisée puis la cible quantifiée.

Cette méthode qui s’affranchit de l’utilisation d’anticorps est intégrable dans un dispositif médical portatif et permet de quantifier divers biomarqueurs avec une spécificité et une sensibilité élevées, à partir d’échantillons cliniques, dans des situations adaptées à une analyse dite au lit du patient. Les chercheurs travaillent actuellement à la détection de deux biomarqueurs sanguins cardiaques, la troponine et le NT-proBNP ce qui ouvre des perspectives dans le domaine du diagnostic, notamment pour son application aux maladies cardiaques nécessitant un diagnostic rapide. C’est à ce titre que la région Auvergne Rhône-Alpes supporte ces recherches via le projet DEDICATE.

Collaboration : Laboratoire des systèmes microfluidiques et de bio-ingénierie du Département des micro-technologies pour la biologie et la santé (DTBS) au Laboratoire d’électronique et de technologie de l’information du CEA-Grenoble (CEA-Leti).