Un brin d'histoire locale C'est dès le milieu des années 1960 que la spectroscopie Mössbauer fut introduite au CEA-Grenoble (alors CENG) dans le Groupe des Interactions Hyperfines par Jacques Chappert. Et c'est de cette époque que datent les premières études Mössbauer d'une protéine à fer, la ferritine qui fascinait les physiciens par sa capacité à stocker de l'ordre de 4 000 atomes de fer sous la forme de ce qu'on appelle maintenant une nano-particule. Les études Mössbauer de protéines à fer et de modèles chimiques se sont poursuivies dans les années 1970 au sein du DRF où les recherches sur les métaux en biologie étaient déjà actives dans les groupes de Bernard Lamotte, Jean-Claude Marchon et Jacques Meyer. La Plate-forme Mössbauer en Biologie du laboratoire de Physico-chimie des Métaux en Biologie en est directement issue : alors que l'activité Mössbauer était abandonnée par le DRFMC dans les années 2000, deux physiciens Claudine Jeandey et Jean-Louis Oddou choisissaient de la poursuivre dans un autre cadre. C'est à partir de leur expertise qu'un laboratoire Mössbauer fut démarré au DRFMC/Scib. Il fut ensuite transféré au DBMS, et après une dizaine d'années aboutit à la plate-forme actuelle après deux départs en retraite, trois recrutements et des investissements réguliers. Jusqu'à son départ en retraite en 2010, Jean-Louis Oddou put ainsi transmettre son savoir et prit une part cruciale à la montée en puissance de la plate-forme. Spectroscopie Mössbauer : à quoi sert-elle ?La spectroscopie Mössbauer permet de caractériser l'état du fer dans des matériaux très divers. Elle est utilisée dans de nombreux domaines fondamentaux ou appliqués qui mettent en jeu des oxydes ou des composés de fer : physique et chimie du solide, matériaux, corrosion, géochimie et exploration de mars, archéologie, environnement, biologie et médecine. La plate-forme en chiffres
Cryoaimant Oxford Instruments
Spectromag 4000 acquis en 2007 | | • quatre permanents : Martin Clémancey (IE UJF), Ricardo Garcia-Serres (MCF UJF), Geneviève Blondin (DR2 CNRS) et Jean-Marc Latour (DR CEA).
• quatre ensembles de mesure
• deux cryostats et un cryo-aimant (Figure) permettant des mesures de 1,4 à 300 K et avec des champs magnétiques allant de 0,06 à 7 teslas, appliqués parallèlement ou perpendiculairement au rayonnement γ
• des collaborations en France (Grenoble, Lyon, Gif-sur-Yvette, Paris, Brest, Strasbourg), en Europe (Royaume-Uni, Portugal, Espagne, Pays-Bas), aux États-Unis, en Inde et en Asie (Japon, Corée du Sud)
• il existe seulement six installations comparables, trois en Allemagne (Lübeck, Mülheim, Kaiserslautern) et trois aux États-Unis (Carnegie Mellon, Penn State, Texas A&M). |
Lorsqu'ils sont insérés dans un réseau solide, une fraction des atomes de certains nucléides sont capables d'émettre ou d'absorber un rayonnement sans effet de recul. C'est la découverte en 1958 de cet effet éponyme qui valut à Rudolf Mössbauer (1929-2011) l'attribution du prix Nobel de Physique en 1961. Cette propriété est partagée par une quarantaine de nucléides, notamment
57Fe,
119Sn,
61Ni, et des lanthanides et actinides ; cependant, pour des raisons de facilité de mise en œuvre, plus de 95 % des travaux publiés concernent les composés du
57Fe.Le principe de fonctionnement d'un spectromètre Mössbauer est illustré
figure 1A. L'énergie incidente produite par la décomposition de la source au
57Co est modulée par effet Doppler en faisant vibrer la source de façon à balayer une gamme d'énergie dans laquelle les échantillons de
57Fe absorbent.
Figure 1 : A. Principe de fonctionnement d'un spectromètre Mössbauer.
B. Spectre Mössbauer élémentaire.La spectroscopie Mössbauer est une spectroscopie nucléaire qui détecte des transitions entre des niveaux du noyau de
57Fe. En l'absence de champ magnétique, deux transitions sont généralement détectées ( Figure 1B<), dont le barycentre (appelé déplacement isomérique) et la séparation énergétique (appelée écart quadrupolaire) sont caractéristiques de l'environnement du noyau de fer.
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Figure 2. Variation des déplacements isomériques des atomes de fer dans l'état haut spin en fonction de leur degré d'oxydation. | |
Le déplacement isomérique est sensible au degré d'oxydation et à l'état de spin du fer ( Figure 2), et à la nature de son environnement (présence d'oxygène, d'azote, de soufre). L'écart quadrupolaire reflète la symétrie de cet environnement. En présence d'un champ magnétique, six transitions sont généralement détectées dont les énergies et les intensités dépendent de la valeur du champ magnétique et reflètent la structure électronique du fer. La simulation du spectre permet d'analyser la structure électronique de l'ion fer dans son environnement.
Les activités scientifiques de la plate-forme couvrent trois domaines principaux :
• les protéines fer-soufre, biogenèse et activités enzymatiques,
• les espèces à haut degré d'oxydation du fer présentes dans les oxygénases et leurs modèles chimiques, et
• l'étude de systèmes polynucléaires complexes.
La plate-forme réalise également des prestations de service pour l'analyse de matériaux.
 Les centres FeS sont présents dans des systèmes biologiques très anciens mais ce n'est que dans les années 1960 que leur existence a été démontrée et leur composition à partir de fer, de sulfure et de cystéinate établie. Les centres les plus communs comprennent des clusters à deux ou quatre ions fer, mais des nucléarités plus élevées ont été trouvées qui associent parfois des métaux différents du fer. Depuis cinq décennies leur présence ubiquitaire et leurs rôles cruciaux dans des réactions de transfert d'électrons, de synthèse de cofacteurs, de méthylation, d'insertion de soufre, d'isomérisation, etc... ont été amplement décrits. Leur biogenèse requiert des machineries protéiques complexes dont les défaillances chez l'homme sont sources de maladies graves, comme l'ataxie de Friedreich. L'utilisation de la spectroscopie Mössbauer dans ce domaine va être illustrée par trois exemples présentant la caractérisation d'un centre [4Fe4S] et son interaction avec un inhibiteur, la distinction des deux types de centres [2Fe2S] et [4Fe4S] qui permet de suivre leurs formations, et l'accumulation de fer mitochondrial qui intervient lorsque la biosynthèse des centres fer-soufre est altérée.
Exemple 1 : caractérisation d'une protéine fer-soufre et de son interaction avec un inhibiteur
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Figure 3 : A. Spectres Mössbauer enregistrés à 4,2 K de l'enzyme Ec NadA en l'absence (gauche) et en présence (droite) d'un inhibiteur. Les flèches indiquent les variations associées à l'interaction du cluster avec l'inhibiteur. B. Structure du complexe du cluster avec l'inhibiteur déduite de calculs DFT optimisés pour reproduire les paramètres Mössbauer. | |
Dans une étude très récente réalisée en collaboration avec Sandrine Ollagnier-de-Choudens du LCBM nous avons pu mettre en évidence qu'un dithiol inhibiteur de la quinolinate synthase (NadA) agit en se fixant sur le centre [4Fe4S] 2+ de l'enzyme (lettre de l'iRTSV
n°30). La
figure 3A illustre le spectre Mössbauer de l'enzyme en absence et en présence de l'inhibiteur. En absence de l'inhibiteur, le spectre de l'enzyme est constitué par un doublet dont les paramètres sont caractéristiques des centres [4Fe4S] 2+. En présence de l'inhibiteur, le spectre est modifié par l'apparition d'un épaulement à basse énergie et d'un pic à haute énergie (flèches), modifications qui témoignent de l'interaction entre l'inhibiteur et un des ions fer du cluster. Les paramètres Mössbauer ont permis de valider une structure du site actif calculée en utilisant la méthode de la fonctionnelle de la densité.
[1] Cette structure montre qu'un des quatre ions Fe du cluster est chélaté par l'inhibiteur et se différencie des trois autres ( Figure 3B). La présence d'un tel site différencié avait déjà été notée pour l'enzyme RimO impliquée dans la modification de protéines ribosomales.
[2]Exemple 2 : suivi cinétique de la formation d'un centre fer-soufre
Les centres [2Fe2S] 2+ et [4Fe4S] 2+ ont des signatures Mössbauer distinctes et caractéristiques ( Figure 4A) qui permettent de les distinguer et de suivre leurs évolutions. En collaboration avec le groupe du Dr. A. Pastore (NRMD, Londres) nous avons mis à profit cette propriété pour suivre par spectroscopie Mössbauer ( Figure 4B, C) le processus de biosynthèse des centres FeS dans la protéine échafaudage bactérienne IscU en présence et en absence de la protéine CyaY, analogue de la frataxine, afin de révéler son influence. Ces expériences
in vitro montrent qu'en présence de CyaY la synthèse des centres FeS est retardée mais que leur répartition ([2Fe2S]
vs [4Fe4S]) n'est pas affectée.
[3]
Figure 4 : A. Spectres théoriques d'un cluster [2Fe2S]2+ (bleu) et d'un cluster [4Fe4S]2+ (vert). B. Suivi par spectroscopie Mössbauer de la formation des centres FeS dans la protéine échafaudage Ec IscU en l'absence de frataxine (CyaY). C. Même expérience en présence de CyaY. Spectres enregistrés à 4,2 K à des temps de réaction de 0 (noir), 5 (gris) 15 (orange) et 30 min (rouge). Le doublet majoritaire est dû à des espèces fer-soufre inorganiques non liées à la protéine.
Exemple 3 : caractérisation de l'accumulation de fer dans des mitochondries
Figure 5 : Spectres Mössbauer enregistrés à 78 K de mitochondries de levure purifiées de cellules dépourvues des protéines indiquées ou les surexprimant.
A. Δyfh1,
B. Δssq1,
C. Δggc1,
D. Δggc1-YFH1 et
E. Δggc1-FTN. La flèche indique le signal associé à la présence d'ions FeII haut spin. | |
L'ataxie de Friedreich, maladie autosomale récessive, est due à un défaut dans le gène codant pour la frataxine, une protéine impliquée dans l'assemblage des centres fer-soufre dans les mitochondries. Le rôle de la frataxine dans ce processus suscite donc un intérêt particulier depuis une décennie. Lorsque la biosynthèse des centres FeS est empêchée par un défaut dans la frataxine (Yfh1 chez la levure) ou qu'ils ne peuvent pas être transférés aux protéines en raison d'un défaut des protéines chaperones (Ggc1, Ssq1), une accumulation de fer sous forme d'agrégats d'hydroxyde/phosphate est observée dans la mitochondrie. Afin d'estimer quelle peut être la bio-disponibilité du fer accumulé, sa nature chimique a été étudiée en collaboration avec le groupe du Dr. E. Lesuisse (IJM, Paris) sur des mitochondries mutantes déficientes en frataxine (Δyfh1) ou en protéine chaperone (Δggc1, Δssq1). La spectroscopie Mössbauer ( Figure 5) indique que les diverses mutations n'ont pas d'influence sur la nature chimique des agrégats formés.
[4] Par contre, la comparaison de souches déficientes en chaperone Ggc1 et Ssq1 qui surexpriment la frataxine (Δggc1-YFH1, Δssq1-YFH1) ou la ferritine (Δggc1-FTN, Δssq1-FTN) révèle en présence de ferritine l'existence d'un faible pool de Fe II ( Figure 5E) qui est probablement responsable de l'amélioration de la synthèse des hèmes et des fonctions de respiration observée pour ces mutants.
[5]
 Transférer un atome d'oxygène à un substrat peu réactif à partir de l'oxygène moléculaire et dans des conditions douces, constitue toujours un défi posé à la chimie en dépit de plusieurs décennies de recherche. Cette réaction est catalysée dans la nature par les monooxygénases dont le paradigme est la classe des cytochromes P450. Leur mécanisme d'action a été établi très récemment de manière définitive et fait intervenir une espèce à haut degré d'oxydation du fer (FeIV=O) associée à une forme oxydée (radical cation) de l'hème. Des espèces à haut degré d'oxydation du fer sont impliquées aussi dans les monooxygénases non-hémiques. En particulier, l'espèce active de la méthane monooxygénase, enzyme non hémique qui transforme le méthane en méthanol, fait intervenir une paire d'ions FeIV. La détection et la caractérisation de telles espèces dans des enzymes et des catalyseurs d'oxydation suscitent donc un très grand intérêt et donnent lieu à une intense compétition. La méthode incontournable pour caractériser des espèces FeIV est la spectroscopie Mössbauer du fait de leurs signatures spectrales spécifiques.
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Figure 6 : A. Réaction de formation de l'espèce active 3 dans la catalyse d'oxydation du méthane à partir de la bis-porphyrine de fer 1. B. Spectres Mössbauer de l'espèce active enregistrés à 4,2 K avec les champs magnétiques indiqués sur la figure. |
C'est dans ce cadre, qu'en collaboration avec le groupe du Dr. A. Sorokin (IRCE, Lyon) nous avons étudié l'espèce 3 ( Figure 6A) qui est capable d'oxyder le méthane en méthanol, ce qui est extrêmement rare pour un composé moléculaire. L'espèce 3 est générée par réaction de la bis-porphyrine de Fe (1 dans la
figure 6A) avec un peracide (acide
m-chloroperbenzoïque,
m-CPBA) en solvant organique à très basse température (-90 °C). Nous avons pu établir que 3 est une espèce oxo bis-Fe IV avec une porphyrine oxydée en radical cation. Cette conclusion découle de l'étude Mössbauer effectuée avec un champ magnétique appliqué ( Figure 6B) qui a montré que l'entité bis-Fe IV avait un spin S = 0 et n'interagissait que très faiblement avec le radical porté par une des deux porphyrines.
[6] Cette structure électronique rappelle celle de l'espèce active du cytochrome P450 qui associe un centre Fe IV oxo à une porphyrine oxydée. Elle s'en distingue par la présence d'un Fe IV additionnel qui augmente encore la capacité oxydante du système et lui permet d'oxyder le méthane, ce que le cytochrome P450 n'est pas capable de réaliser. Des études similaires ont été effectuées en collaboration avec le groupe coréen du Pr. W. Nam (Séoul) sur des systèmes non hémiques d'activité comparable.
[7, 8]
 De nombreuses métalloprotéines possèdent des sites actifs multimétalliques. Dans le cas du fer, des arrangements complexes sont observés et l'interprétation de leurs comportements requiert l'étude de composés synthétiques similaires dont les propriétés sont parfaitement établies. Dans ce cadre, nous étudions divers complexes bi et tétranucléaires pour caractériser leurs propriétés magnétiques et spectroscopiques. Ainsi, nous avons étudié le comportement magnétique et les propriétés spectrales d'un complexe binucléaire fer-manganèse représenté sur la
figure 7A qui modélise le site actif d'enzymes récemment découvertes qui réagissent avec l'oxygène moléculaire. Afin de rendre compte des propriétés de ce composé dans l'état FeIIMnII, qui est actif en RPE (Figure 7B), le programme Mössbauer développé avec le support du GIPSE de l'iRTSV a été implémenté pour inclure la simulation conjointe de ce dernier et des quatre spectres Mössbauer (Figure 7C) enregistrés à 4,2 K sous divers champs magnétiques appliqués. La méthodologie mise en œuvre et les résultats obtenus serviront de référence pour l'étude des systèmes naturels.
[9] Une étude similaire d'un complexe tétranucléaire a été réalisée en collaboration avec le groupe du Pr. J. Reedijk (Leiden, Pays-bas)
[10]
Figure 7. A. Structure cristalline du complexe binucléaire FeIIIMnII. B. Spectre RPE du complexe FeIIMnII enregistré à 4,2 K en bande X. C. Spectres Mössbauer du complexe FeIIMnII enregistré à 1,4 K (spectres a, c, e) et 4,2 K (spectres b, d, f) avec les champs magnétiques indiqués sur la figure.
Les développements engagés et prévus pour la plate-forme ont un double objectif : améliorer la précision des informations qui sont tirées des diverses expériences réalisées en les combinant à d'autres techniques, et améliorer la précision des mesures afin de travailler sur des échantillons complexes. Plusieurs des travaux récents ou en cours ont été réalisés en collaboration avec des chercheurs du Laboratoire de Résonances Magnétiques (irig). En effet, l'utilisation conjointe des spectroscopies Mössbauer et RPE permet une analyse spectroscopique approfondie des échantillons complexes de protéines, notamment en faisant varier leurs états d'oxydation.
[11] De même, les propriétés Mössbauer permettent de valider (ou non) les modèles structuraux construits par des calculs DFT et au final d'obtenir des descriptions structurales plausibles des centres à fer.
[1] Ces approches seront poursuivies et intensifiées. Au plan instrumentation, après avoir acquis trois cryostats en 2007, 2009 et 2012 l'effort portera sur l'amélioration des chaînes électroniques de mesure afin d'optimiser les conditions d'acquisition des spectres. Ces développements sont rendus nécessaires par différents projets qui impliqueront de travailler non seulement sur des protéines isolées mais aussi sur des organelles, des cellules voire des tissus. L'objectif est de réaliser des analyses quantitatives des différents types de protéines à fer (hèmes, fer-soufre, non-hèmes, ferritine) existant dans des cellules mises en conditions de stress ou présentant des altérations pathologiques.  [1]
Chan A, Clémancey M, Mouesca JM, Amara P, Hamelin O, Latour JM and Ollagnier de Choudens S. Studies of inhibitor binding to the [4Fe-4S] cluster of quinolinate synthase.
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